Diabetes melitus, penyakit kronis yang memengaruhi jutaan orang di seluruh dunia, membutuhkan insulin sebagai pengobatan utama. Dahulu, insulin diekstraksi dari pankreas hewan, sebuah proses yang mahal, terbatas, dan berpotensi menimbulkan reaksi alergi. Namun, revolusi dalam bioteknologi, khususnya pemanfaatan teknologi plasmid, telah mengubah cara kita memproduksi insulin, membuatnya lebih aman, terjangkau, dan tersedia secara luas. Artikel ini akan menjelaskan secara detail tahapan teknologi plasmid dalam pembuatan hormon insulin, mulai dari isolasi gen hingga produk akhir yang siap digunakan.
1. Isolasi dan Kloning Gen Insulin:
Perjalanan menuju insulin rekombinan dimulai dengan isolasi gen insulin manusia. Gen ini, yang bertanggung jawab atas produksi insulin di dalam tubuh, diidentifikasi dan diisolasi dari sel pankreas manusia. Proses isolasi ini melibatkan berbagai teknik molekuler, termasuk:
- Ekstraksi DNA genomik: DNA manusia diekstraksi dari sel pankreas. Proses ini melibatkan lisis sel untuk melepaskan DNA dan kemudian pemurnian DNA dari komponen seluler lainnya menggunakan berbagai metode seperti sentrifugasi dan presipitasi.
- Amplifikasi gen insulin menggunakan PCR (Polymerase Chain Reaction): Karena gen insulin hanya sebagian kecil dari keseluruhan genom manusia, PCR digunakan untuk memperbanyak salinan gen insulin secara eksponensial. Primer spesifik yang dirancang untuk mengapit sekuens gen insulin digunakan dalam reaksi PCR.
- Kloning gen insulin ke dalam vektor plasmid: Plasmid, molekul DNA sirkuler kecil yang terdapat pada bakteri, bertindak sebagai vektor kloning. Gen insulin yang telah diamplfikasi kemudian disisipkan ke dalam plasmid menggunakan enzim restriksi dan ligase DNA. Enzim restriksi berfungsi sebagai “gunting molekuler” yang memotong plasmid pada tempat spesifik, sementara DNA ligase “merekatkan” gen insulin ke plasmid yang telah terpotong.
Pemilihan plasmid sebagai vektor sangat penting karena plasmid memiliki beberapa sifat yang menguntungkan, antara lain:
- Replikasi otonom: Plasmid dapat bereplikasi secara independen di dalam sel bakteri, menghasilkan banyak salinan gen insulin.
- Selektabilitas: Plasmid biasanya mengandung gen penanda seleksi, seperti gen resistensi antibiotik. Hal ini memungkinkan identifikasi bakteri yang telah berhasil menerima plasmid yang mengandung gen insulin.
- Mudah dimanipulasi: Plasmid relatif mudah diisolasi, dipotong, dan dihubungkan dengan DNA lain.
2. Transformasi Bakteri:
Setelah gen insulin berhasil disisipkan ke dalam plasmid, langkah selanjutnya adalah memasukkan plasmid yang dimodifikasi ke dalam sel bakteri. Proses ini dikenal sebagai transformasi. Beberapa metode transformasi yang umum digunakan meliputi:
- Transformasi kimia: Sel bakteri diperlakukan dengan senyawa kimia tertentu untuk meningkatkan permeabilitas membran sel, sehingga plasmid dapat masuk ke dalam sel.
- Elektroporasi: Sel bakteri diberi pulsa listrik tegangan tinggi untuk membuat pori-pori sementara pada membran sel, memungkinkan plasmid untuk masuk.
Setelah transformasi, sel bakteri yang telah menerima plasmid ditumbuhkan pada media pertumbuhan yang mengandung antibiotik yang sesuai dengan gen penanda seleksi pada plasmid. Hanya bakteri yang mengandung plasmid yang mampu bertahan hidup dan tumbuh dalam media tersebut.
3. Ekspresi Gen Insulin:
Bakteri yang mengandung plasmid yang membawa gen insulin kemudian ditumbuhkan dalam bioreaktor berskala besar di bawah kondisi yang optimal untuk ekspresi gen insulin. Kondisi ini meliputi suhu, pH, dan nutrisi yang tepat. Gen insulin akan ditranskripsi menjadi mRNA, yang kemudian diterjemahkan menjadi protein insulin preproinsulin di dalam ribosom bakteri.
Preproinsulin adalah bentuk prekursor insulin yang mengandung peptida sinyal yang akan dipotong selama pemrosesan pasca-translasi. Proses pemrosesan ini melibatkan pemotongan peptida sinyal dan pemotongan proinsulin menjadi rantai A dan rantai B insulin, yang kemudian dihubungkan oleh ikatan disulfida.
4. Pemurnian Insulin:
Setelah proses fermentasi, insulin yang dihasilkan perlu dimurnikan dari komponen sel bakteri lainnya. Proses pemurnian ini melibatkan beberapa tahapan, termasuk:
- Lysis sel: Sel bakteri dipecah untuk melepaskan insulin.
- Pemisahan dan pemurnian: Berbagai teknik pemisahan digunakan untuk memisahkan insulin dari komponen sel lainnya, seperti kromatografi afinitas, kromatografi ion-pertukaran, dan filtrasi ultra. Teknik-teknik ini memanfaatkan perbedaan sifat fisikokimia antara insulin dan kontaminan lainnya.
- Verifikasi kualitas: Insulin yang telah dimurnikan diuji untuk memastikan kemurnian, potensi, dan ketiadaan kontaminan. Uji sterilitas, uji toksisitas, dan uji potensi biologi dilakukan untuk memastikan keamanan dan efektivitas produk.
5. Formulasi dan Pengemasan:
Insulin yang telah dimurnikan kemudian diformulasi menjadi sediaan yang sesuai untuk penggunaan klinis. Formulasi ini dapat berupa larutan injeksi atau suspensi, yang disesuaikan dengan kebutuhan pasien. Sediaan insulin kemudian dikemas dan disterilisasi untuk memastikan keamanan dan stabilitas produk.
Keunggulan Teknologi Plasmid dalam Produksi Insulin:
Penggunaan teknologi plasmid dalam produksi insulin memiliki beberapa keunggulan signifikan dibandingkan dengan ekstraksi dari pankreas hewan, antara lain:
- Produksi massal: Teknologi plasmid memungkinkan produksi insulin dalam jumlah besar, sehingga memenuhi permintaan global.
- Keamanan: Insulin rekombinan tidak mengandung kontaminan hewan, sehingga mengurangi risiko reaksi alergi dan penyakit menular.
- Kemurnian: Proses pemurnian memastikan bahwa insulin yang dihasilkan memiliki kemurnian tinggi.
- Biaya yang lebih rendah: Produksi insulin dengan teknologi plasmid lebih efisien dan terjangkau dibandingkan dengan ekstraksi dari pankreas hewan.
- Konsistensi: Insulin yang dihasilkan melalui teknologi plasmid memiliki kualitas dan potensi yang konsisten.
Kesimpulan:
Teknologi plasmid telah merevolusi produksi insulin, mengubah pengobatan diabetes melitus dari metode yang terbatas dan mahal menjadi metode yang aman, terjangkau, dan tersedia secara luas. Proses ini, mulai dari isolasi dan kloning gen insulin hingga formulasi dan pengemasan produk akhir, melibatkan tahapan yang kompleks namun presisi, menunjukkan kemajuan luar biasa dalam bioteknologi dan dampak positifnya terhadap kesehatan manusia. Pengembangan teknologi ini terus berlanjut, dengan fokus pada peningkatan efisiensi produksi, pengembangan formulasi yang lebih baik, dan penciptaan insulin analog dengan sifat farmakologis yang ditingkatkan. Hal ini menjanjikan masa depan yang lebih cerah bagi penderita diabetes di seluruh dunia.
penulis zanuar farel cristian